南京爱贝生物的小鼠体外受精操作步骤及操作视频

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体外受精技术资料 2021-01-14

下述操作有视频资料，仅供参考

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提取码：1234

试剂耗材准备

1	PMSG	10	200 μL移液器
2	hCG	11	灭菌眼科剪2把
3	1mL 注射器	12	灭菌眼科镊2把
4	M2培养液	13	体视显微镜
5	TYH培养液	14	倒置显微镜
6	HTF培养液	15	二氧化碳培养箱(37℃, 5% CO2, 95% air)
7	KSOM培养液	16	胚胎转移用口吸管
8	矿物油	17	1 .5 mm毛细玻璃管
9	独立包装一次性塑料巴氏吸管	18	35 mm胚胎培养皿

1.超数排卵

●每只雌鼠(8-12周龄)注射PMSG 5-10 IU(0.1-0.2 mL)。(一般在14:00 —18:00之间注射)。

●48小时后注射hCG 5 IU（0.1 mL）。

●在注射hCG后14-16 h进行受精，通常于次日 9:00-11:00 处死小鼠取卵。

小鼠腹腔注射方法

抓住小鼠颈部靠近耳朵处的皮肤，以防止其转头，并将尾巴缠绕于小手指固定。使用1 mL注射器以 45°角斜向刺入腹腔，注意不要刺伤膈肌及其他器官。轻轻回抽，确认无血液回流后注射液体。稍等片刻后再拔针，以防液体渗漏。操作时请佩戴防咬手套;如被咬伤，应立即就医处理。

南京爱贝生物的小鼠体外受精操作步骤及操作视频(图1)

图1-1 腹腔注射示意图

2.培养皿准备

注射hCG当日准备下述培养皿过夜平衡。每制备2个皿应立即加入矿物油覆盖微滴，避免培养液中的水分蒸发，影响渗透压。培养皿盖应注明实验名称缩写（皿盖侧面也需标注），日期及培养液名。当一个实验的皿超过2个，应在皿盖上注明XX1、XX2等表明顺序。培养皿底部应依次标注胚胎序号。

●HTF受精皿准备。

注意：用于精卵结合，在超净工作台内制备，注意无菌操作。需要多准备一个清洗皿。

步骤1：用灭菌200 μL枪头吸取200 μL HTF培养液做滴。

步骤2：从侧壁缓缓加入矿物油约2 mL直至没过培养滴。请勿直接对着培养液加油，防止将滴冲散。

步骤3：将培养皿置于二氧化碳培养箱中(37℃, 5% CO₂ )，过夜平衡。

南京爱贝生物的小鼠体外受精操作步骤及操作视频(图2)

图2-1 培养皿制作示意图

●精子获能皿准备。

用于附睾精子获能，在超净工作台内制备，注意无菌操作。HTF液或TYH液，制作步骤同上。

●KSOM培养皿准备。

用于培养受精卵至囊胚期，KSOM培养液中已含有丙酮酸和葡萄糖，中途不需要换液。每个培养皿可制备10个培养滴，每滴30 μL，每个滴放10枚胚胎。在皿底反面用记号笔给滴编号。制作步骤同上。

3.精子获能

●取卵当日先杀雄鼠取附睾尾部精子获能。快速颈椎脱臼法处死雄性小鼠（图3-1）：把小鼠放在鼠笼上面，使它前爪抓住笼子上面的钢丝条，紧紧压住它的颈部，同时水平向后拉伸尾部，使其断颈。

南京爱贝生物的小鼠体外受精操作步骤及操作视频(图3)

图3-1 快速颈椎脱臼法处死小鼠示意图

●将小鼠放在纸上，用75%的乙醇消毒腹部。

●用眼科弯剪在腹部皮肤做一小切口，将皮肤向头部方向剥离，完全暴露腹部。剪开腹膜，暴露内脏器官。在腹部的最下端位置可见大量脂肪层，用镊子夹着脂肪层轻轻向小鼠头方向牵引能看一睾丸被牵出。

●成年小鼠的睾丸大约有一粒黄豆大，在睾丸下方一点与睾丸相连的位置，能看到白色附睾，其表面可见曲精小管结构（图3-2）。

图3-2 雄鼠睾丸结构示意图

●找到附睾后，迅速用眼科剪和眼科镊将附睾及输精管剪下置于精子获能滴中，用注射器针头将附睾尾划破，待精子溢出后，培养箱孵育10 min，取出体视镜下观察，精子扩散后，放入培养箱继续孵育50 min后可用。

南京爱贝生物的小鼠体外受精操作步骤及操作视频(图5)

图3-3 附睾尾精子释放示意图

4.取卵

●精子获能后，将M2培养液铺满整个皿底，矿物油覆盖，置于37℃加热平板上加热30 min。M2培养液含有HEPES，可以在二氧化碳培养箱外维持pH值稳定，因此只需要加温即可。

●精子获能50 min后，快速颈椎脱臼法处死雌性供体小鼠。

●将小鼠放在纸上，用75%的乙醇消毒腹部。

●用第一套眼科镊捏住皮肤并用眼科剪在皮肤上做一小切口。然后用力将皮肤拉到头部，完全暴露腹部。然后用第二套器械剪开腹膜，完全暴露内脏器官。将肠管拉向一侧后即可在腹腔中见到两侧的子宫和相连的卵巢。卷曲的输卵管在卵巢和子宫之间（图4-1）。（注意不能用剪开皮肤的眼科剪和眼科镊去剪腹膜和输卵管，防止出现污染）。